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该研究系统比较了双顺反子表达载体中轻链和重链基因位置对单克隆抗体表达效率的影响，并通过多种分析技术验证了抗体的结构与功能特性，为优化重组抗体生产策略提供了重要参考。
文献概述
本文《Structural and Functional Characterization of Anti-SARS-CoV-2 Spike Monoclonal Antibodies Produced via Bicistronic Expression in CHO Cells》发表于《Antibodies》杂志，回顾并总结了抗SARS-CoV-2刺突蛋白单克隆抗体的表达与质量属性分析。文章系统地评估了两种不同双顺反子载体构建方式在CHO细胞中的表达水平，并通过SDS-PAGE、Western blot、圆二色性、内源性色氨酸荧光、SEC-HPLC、斑点印迹、表面等离子体共振、N-糖基化分析以及透射电镜等多种手段对单抗的结构与功能进行深入分析。
背景知识
单克隆抗体（mAbs）是生物制药中增长最快的产品类别之一，其高效表达是实现规模化生产的关键技术因素。在表达过程中，轻链（LC）和重链（HC）的表达比例对于正确折叠、组装和分泌至关重要。当前主流表达策略包括共转染两个独立质粒、使用多启动子载体、基于F2A肽的多顺反子系统以及基于IRES（内部核糖体进入位点）的表达系统。其中，IRES元件来源于病毒mRNA的5'非翻译区，可以实现不依赖5'帽结构的下游基因翻译，因此在双顺反子载体中具有重要应用。然而，不同IRES元件的翻译效率及其对表达比例的影响仍需进一步优化。此外，mAbs的结构与功能特性，如二级、三级和四级结构、糖基化修饰、抗原结合能力等，是确保其治疗效果和安全性的关键质量属性。目前，抗SARS-CoV-2单抗的研究不仅关注其表达水平，也强调其在不同变异株中的广谱中和能力。本文通过使用天然EMCV IRES元件构建双顺反子载体，系统评估了两种中和抗体在CHO细胞中的表达效率与质量属性，为优化表达策略提供了实验证据。
研究方法与实验
研究团队构建了两种双顺反子表达载体，分别将轻链（LC）或重链（HC）基因置于IRES元件的上游，使用瞬时转染的CHO细胞表达系统（ExpiCHO™）进行表达比较。随后，通过蛋白A亲和纯化、定量分析、SDS-PAGE、Western blot、圆二色性光谱、内源性色氨酸荧光、SEC-HPLC、斑点印迹、表面等离子体共振（SPR）、N-糖基化分析（HILIC-HPLC和LC-MS）以及透射电镜（TEM）等手段对表达产物进行结构和功能分析。此外，还使用统计学方法（单因素方差分析和Sidak多重比较测试）评估不同构建体之间的表达差异。
关键结论与观点
研究意义与展望
本研究为优化双顺反子抗体表达策略提供了实验证据，表明轻链基因优先表达有助于提高mAb产量并减少聚集。同时，两种单抗在结合不同变异株上的差异提示其在抗原识别上的多样性，可能与轻链可变区基因使用有关。未来研究可进一步探索IRES元件序列优化、CHO细胞稳定表达株筛选以及更高分辨率结构分析技术（如cryo-EM）以明确抗原结合位点的构象变化。此外，针对Omicron等逃逸变异株的广谱中和抗体开发仍为亟需解决的问题。
结语
本研究系统评估了双顺反子表达载体中轻链和重链基因位置对抗SARS-CoV-2刺突蛋白单抗表达效率与质量属性的影响，结果表明轻链位于IRES上游可显著提高表达水平并减少聚集。通过结构分析与功能验证，两种单抗均保持了正确的二级、三级和四级结构，并显示出对多种SARS-CoV-2变异株的结合能力，但对Omicron BA.2结合能力缺失。研究进一步强调了基因位置对表达水平的重要性，并为CHO细胞表达系统中单抗的优化设计提供了实验证据，具有广泛的应用前景。
